大鼠乳鼠成骨细胞培养培养可以：（1）获得大鼠乳鼠成骨细胞；（2）用于骨修复的细胞学机制研究。     实验方法：

    酶消化法

    实验方法原理取材于出生2~3d小鼠颅骨，以含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，采用胶原酶消化法分离成骨细胞，并进行细胞接种与传代。采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。

    实验材料：

    SD大鼠

    试剂、试剂盒

    F12完全培养液胰蛋白酶Ⅱ型胶原酶酒精

    仪器、耗材

    手术器械磁力搅拌器

    实验步骤

    一、实验步骤

    1.拉颈处死24小时内新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5min，取出头盖骨，分离顶骨和额骨，冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血，放入另一盛有F12完全培基液的培养皿中再洗涤，将颅骨剪成2～5mm2碎片，将洗涤过的骨碎片用0.25%胰蛋白酶2ml预消化15min，以清除纤维组织细胞，弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。

    2.然后以0.1%Ⅱ型胶原酶10ml，在37℃环境中消化20分钟，室温下磁力搅拌消化20分钟。静置数分钟，收集消化液，室温下以1200rpm离心10分钟。去除上清液，用20%胎牛血清的F12培养液4ml悬浮细胞，接种于75ml培养瓶中，补培养液8ml使每瓶液体量达到12ml；对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20分钟、磁力搅拌消化15分钟、离心10分钟，将获得的3瓶细胞放置于二氧化碳培养箱，在5%CO2，95%空气，37℃温度下培养，24小时后可见细胞贴壁生长，胞质开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔48小时换培养液(注：消化视具体情况而定，也可多消化1遍)。

    3.原代培养一般接种后第7天能长满。传代时，取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞1瓶，弃去培养液，传代时先以PBS冲洗2遍，加0.25%胰酶1ml，室温下消化3～5分钟，将胰蛋白酶液弃去，加F12培养液充分吹打8-10分钟。将已消化的细胞收集、合并，计数；用F12完全培基调节至细胞浓度为合适浓度。一般取2-5代成骨细胞进行实验。代数太多，细胞老化或者分化明显。

    二、结果

    如图所示，成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似，但是不同的是，比成纤维细胞更不容易消化，尤其是传代次数多，细胞老化的时候，非常难消化，并且不易消化成单个细胞。

    三、鉴定的方法

    1.碱性磷酸酶(ALP)活性检测

    2.骨玻璃样蛋白(BGP)检测

    3.矿化结节检测

    其他

    一、讨论

    成骨细胞包绕在硬组织中，致使处理困难，可采用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA处理并经胶原酶消化，均可培养出成骨细胞。体外培养的成骨细胞保持有骨组织细胞的某些特征。据文献报道，不同方法培养的成骨细胞形态是不同的[1]。