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原位杂交实验要求及步骤

人阅读 发布时间:2016-01-27 16:12

    原位杂交的常用液体配制

    1乔羽生物试剂盒中杂交液和预杂交液的配制

    去离子甲酰胺……………….…………………..500ml(50%终浓度)

    20Xssc(或SSPE)………………………………250ml(5X终浓度)

    50XDenhardt……………………………………..100ml(5X终浓度)

    10%SDS……………………………….………….50ml(0.5%终浓度)

    变性鲑鱼精DNA……………………………..100ug/ml临用前加

    硫酸葡聚糖………………………………………...100g(10%终浓度)预杂交液不加DEPC灭活RNA酶的去离子水定容至1000ml

    Denhardt’s液通常配成50×储备液

    聚蔗糖(Ficoll400)………………………………10g

    聚乙烯吡铬烷酮(PVP)………….………………10g

    牛血清白蛋白全组份(BSA)…………………….10g

    DEPC灭活RNA酶的去离子水定容至1000ml

    2,20Xssc,2Xssc,0.2Xssc缓冲液的配制

    氯化钠……………………………………………..175.3g(20X)

    柠檬酸三钠………………………………………....88.2g(20X)

    DEPC灭活RNA酶的去离子水定容至1000ml2Xssc,0.2Xssc依次稀释10倍3,0.1molPBS缓冲液的配制

    NaCL.............................................4gKCL..........................................0.1g

    Na2HPO4.12H2O...................1.445gKH2PO4..................................0.1g

    注意:在500mlDEPC灭活RNA酶的去离子水中依次溶解上述试剂;5.6%NaCO3调pH至7.2左右。4,0.1mol枸橼酸缓冲液的配制

    枸橼酸三钠……………………….3g枸橼酸…………………….………0.4gDEPC灭活RNA酶的去离子水定容至1000ml

    5,0.1molTBS缓冲液的配制

    NaCL………………………….8.5gTris………………………….……1.2g

    DEPC灭活RNA酶的去离子水定容至1000ml用0.9-1ml乙酸调PH至7.56,复合消化液的配制

    蛋白酶K(ProteinaseK)的消化作用在ISHH中是应用于蛋白消化的关键步骤,其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用酶k1μg/ml(于0.1mol/LTris/50mmol/LEDTA,pH8.0缓冲液中),37℃孵育15~20min,以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用,从而提高杂交信号。在蛋白酶K消化后,应用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用,甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构,通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等(1987)报告应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100μg/ml(用0.1nHCl配)37℃、30min进行消化,所获实验结果优于蛋白酶K。蛋白酶K………………………100ug胃蛋白酶……………………….2mg

    EDTANa4...................................0.01g

    溶于0.1mol枸橼酸缓冲液100ml(灭活RNA酶的去离子水配制的枸橼酸缓冲液)7,组织细胞打孔液的配制

    0.1mol枸橼酸缓冲液………….99.5ml曲拉通X-100………………0.5ml 原位杂交实验要求及步骤,以上只是简单详解,如有不解请来电乔羽生物(电话:021-51867124  QQ:3063139112),我司相关技术人员会为您解答!

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