人白细胞介素6（IL-6）ELISA检测试剂盒使用说明书

检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人白细胞介素6（IL-6）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人白细胞介素6（IL-6）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法
2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品
1.     酶标仪（450nm）
2.     高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.     37℃恒温箱

操作注意事项
1.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.  标准品稀释液即可视为阴性对照或者空白；预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。
4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称	96孔配置	48孔配置	备注
微孔酶标板	12孔×8条	12孔×4条	无
标准品（48 pg/ml）	0.6mL	0.6mL	按说明书进行稀释
标准品稀释液	6mL	3mL	无
样本稀释液	6mL	3mL	无
检测抗体-HRP	10mL	5mL	无
20×洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2张	2张	无
说明书	1份	1份	无
自封袋	1个	1个	无

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：48、24、12、6、3、1.5 pg/ml
试剂的准备
 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法
1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤
1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.  待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；
4.  随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能
1.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.  灵敏度：最低检测浓度小于1.0pg/ml。
3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.  有效期：6个月

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