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石蜡切片免疫组化实验
人阅读 发布时间：2017-02-03 14:35
石蜡切片免疫组化实验
主要试剂
染色缸；染色架；保湿盒；晾片盘；微量移液器；0.2 MPBS，乙醇，二甲苯，BSA，中性树胶等
实验步骤
二、包埋组织
1. 在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐。
2. 将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
三、切片
1. 将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致。
2. 调节切片的厚度，一般为 5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于 40 ℃ 温水中。
四、捞组织
当组织载玻片置于 40 ℃ 温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下 1/3 或者下 1/2 一般每种组织捞 5～6 张，其中 2～3 张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入 37 ℃ 温箱中烘干。
五、脱蜡
依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100% 酒精-100% 酒精-95% 酒精-90% 酒精-80% 酒精-70% 酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放 10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为 12～15 min。
六、抗原修复
脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入 3% H2O2 浸泡 10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉 H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
七、血清封闭
冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗 2 次，并将载玻片置于 PBS 中 5 min，洗 2 次，擦干组织周围的 PBS 液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入 37 ℃ 温箱中半小时。血清稀释 10 倍（900 ul PBS：100 ul 血清封闭液）。
八、加一抗
将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加 PBS。加完一抗后于 4 ℃ 冰箱中保存过夜。
九、加二抗
将载玻片从冰箱中取出，放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上二抗，然后置于 37 ℃ 温箱中半小时。
十、加 SABC
将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上 SABC，然后置于 37 ℃ 温箱中半小时。SABC 稀释 100 倍（990ul PBS：10ul SABC）。
十一、加显色剂
将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上显色剂。（显色剂的配置：在 1 ml 水中加 1 滴显色剂 A，摇匀，然后加 1 滴显色剂 B，摇匀，再加 1 滴显色剂 C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
十二、复染
将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织 3～5 min。
十三、脱水
将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入 70% 酒精-80% 酒精-90% 酒精-95% 酒精-100% 酒精-100% 酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置 2 min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
十四、封片
用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
免疫组化石蜡切片保存：
对于石蜡切片，一般把它放在四度冰箱里，你的片盒外面最好包两层塑料袋，系紧，起一密封作用。等你要做实验的时候，拿出来后不要立刻打开它，等它自然恢复至室温，然后打开片盒。这样做的目的就是防止切片变湿。即使这样，切片放置的时间也不要太长，有时间就快做了。如果切片是放在室温状况下，那保存的时间应该更短了，我们的经验是室温放置的切片时间一长就不出结果。
冰冻切片的保存。如果你是要做漂染，你的切片就应该放在原来的固定液中，四度可以保留一个月，如果你是贴片的话，切片就应该保存在 -20 度的冰箱中，这样可以保存一段时间，千万不能让它干燥！
石蜡切片免疫组化实验—快速酶免疫组化二步法
实验原理：
根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子, 其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。
实验材料：
石蜡切试剂、试剂盒、PBS、柠檬酸盐缓冲液、蒸馏水、增强剂、酶标抗鼠/兔聚合物、苏木素、酒精、二甲苯、树胶盐酸、二氨基联苯胺、仪器、耗材、烘箱、微波盒、塑料切片架、显微镜、胶头滴管
实验步骤：
1. 石蜡切片置于 67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3 × 3』）。
2. 取一定量 pH = 6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗 2 × 3』（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）。
3. 每张切片加 1 滴 3% H2O2，室温下孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗 3 × 3』。
4. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育 2 小时。
5. PBS 冲洗 3 × 5』。除去 PBS 液，每张切片加 1 滴聚合物增强剂，室温下孵育 20 分钟。PBS 冲洗 3 × 3』。
6. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育 30 分钟。PBS 冲洗 3 × 5』。
7. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴新鲜配制的 DAB 液（二氨基联苯胺），显微镜下观察 5 分钟。
8. 苏木素复染，0.1% HCl 分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。展开
其他：
1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP） 的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的 HRP 分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较 SABC、SP 法高。
2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比 SABC、SP 法清晰。
3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需 15 分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比 SABC、SP 法大为缩短。
主要试剂
染色缸；染色架；保湿盒；晾片盘；微量移液器；0.2 MPBS，乙醇，二甲苯，BSA，中性树胶等
实验步骤
| 一、洗载玻片 1. 将载玻片置于重铬酸钾和浓 H2SO4 混合液中，目的是为了是载玻片上的硅胶等除去，同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整，便于组织吸附。 2. 置于清水中清洗，除去残余的重铬酸钾和浓 H2SO4（大约冲一个小时左右）。 3. 将载玻片浸泡于酒精之中，然后放到架子上，置于 37 ℃ 温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于 Lys 带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。 |
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1. 在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐。
2. 将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
三、切片
1. 将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致。
2. 调节切片的厚度，一般为 5 um，如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于 40 ℃ 温水中。
四、捞组织
当组织载玻片置于 40 ℃ 温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下 1/3 或者下 1/2 一般每种组织捞 5～6 张，其中 2～3 张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入 37 ℃ 温箱中烘干。
五、脱蜡
依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100% 酒精-100% 酒精-95% 酒精-90% 酒精-80% 酒精-70% 酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯，依据的是相似相溶的原理。一般在每个试剂中放 10 min，天气热可以少放几分钟，相反，天气较冷的话就要适当延长脱蜡时间，一般为 12～15 min。
六、抗原修复
脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入 3% H2O2 浸泡 10 min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉 H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮 3 min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
七、血清封闭
冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗 2 次，并将载玻片置于 PBS 中 5 min，洗 2 次，擦干组织周围的 PBS 液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入 37 ℃ 温箱中半小时。血清稀释 10 倍（900 ul PBS：100 ul 血清封闭液）。
八、加一抗
将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加 PBS。加完一抗后于 4 ℃ 冰箱中保存过夜。
九、加二抗
将载玻片从冰箱中取出，放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上二抗，然后置于 37 ℃ 温箱中半小时。
十、加 SABC
将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上 SABC，然后置于 37 ℃ 温箱中半小时。SABC 稀释 100 倍（990ul PBS：10ul SABC）。
十一、加显色剂
将片子从温箱中取出, 放入 PBS 中洗 3 次，每次 5 min，擦干组织周围的 PBS 后加上显色剂。（显色剂的配置：在 1 ml 水中加 1 滴显色剂 A，摇匀，然后加 1 滴显色剂 B，摇匀，再加 1 滴显色剂 C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
十二、复染
将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织 3～5 min。
十三、脱水
将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入 70% 酒精-80% 酒精-90% 酒精-95% 酒精-100% 酒精-100% 酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置 2 min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
十四、封片
用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
免疫组化石蜡切片保存：
对于石蜡切片，一般把它放在四度冰箱里，你的片盒外面最好包两层塑料袋，系紧，起一密封作用。等你要做实验的时候，拿出来后不要立刻打开它，等它自然恢复至室温，然后打开片盒。这样做的目的就是防止切片变湿。即使这样，切片放置的时间也不要太长，有时间就快做了。如果切片是放在室温状况下，那保存的时间应该更短了，我们的经验是室温放置的切片时间一长就不出结果。
冰冻切片的保存。如果你是要做漂染，你的切片就应该放在原来的固定液中，四度可以保留一个月，如果你是贴片的话，切片就应该保存在 -20 度的冰箱中，这样可以保存一段时间，千万不能让它干燥！
石蜡切片免疫组化实验—快速酶免疫组化二步法
实验原理：
根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子, 其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。
实验材料：
石蜡切试剂、试剂盒、PBS、柠檬酸盐缓冲液、蒸馏水、增强剂、酶标抗鼠/兔聚合物、苏木素、酒精、二甲苯、树胶盐酸、二氨基联苯胺、仪器、耗材、烘箱、微波盒、塑料切片架、显微镜、胶头滴管
实验步骤：
1. 石蜡切片置于 67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3 × 3』）。
2. 取一定量 pH = 6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗 2 × 3』（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）。
3. 每张切片加 1 滴 3% H2O2，室温下孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗 3 × 3』。
4. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育 2 小时。
5. PBS 冲洗 3 × 5』。除去 PBS 液，每张切片加 1 滴聚合物增强剂，室温下孵育 20 分钟。PBS 冲洗 3 × 3』。
6. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育 30 分钟。PBS 冲洗 3 × 5』。
7. 除去 PBS 液，每张切片加 1 滴新鲜配制的 DAB 液（二氨基联苯胺），显微镜下观察 5 分钟。
8. 苏木素复染，0.1% HCl 分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。展开
其他：
1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP） 的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的 HRP 分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较 SABC、SP 法高。
2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比 SABC、SP 法清晰。
3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需 15 分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比 SABC、SP 法大为缩短。
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