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乔羽生物-怎样选择适合你实验的Elisa试剂盒
人阅读 发布时间：2016-10-08 11:18
ELISA试剂盒在实验室已经相当普及，绝大多数ELISA试剂盒都是用于检测未知样本中抗原的浓度。用试剂盒当然比自己慢慢摸条件快得多，ELISA试剂盒不仅可以让实验更便利，往往还更加精确。现在市面上的ELISA试剂盒既有国产也有进口，数量繁多令人目不暇接，怎样才能选出最适用的产品呢?首先当然得根据我们所要检测的分子进行检测，除此以外也还有一些需要加以考量的因素。
第一步、明确检测何种蛋白。
第二步、明确编码该蛋白的基因与其它哪些物种同源性最好。
第三步、寻找检测这些物种蛋白的试剂盒。
第四步、咨询商家ELISA是试剂盒使用的抗体类型：多抗还是单抗？ 单抗是针对什么抗原决定簇的？
第五步、 做出自己的判断该买哪个试剂盒。
从Elisa试剂盒的灵敏度、特异性、精密度、准确度、简便性、安全性及经济性全面评价：
灵敏度：① 为试剂检出被检物质的最低量的能力；② 为试剂对大量样品中阳性检出的能力；
特异性：常用交叉反应率表示。含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标；
精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围；
准确度：通过添加回收实验进行评价；
简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单；
安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性；
经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理；
试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。
根据实验类型、抗体类型、交叉反应、检测方式来选择Elisa试剂盒
实验类型
ELISA 试剂盒有多种类型，不过它们都有一个共同特点，就是进行抗原捕获。一般捕获形式包括将抗原吸附到微孔板或者用微孔板上的抗体进行捕获。In-cell ELISA和酶联免疫斑点ELISPOT是两种特殊的类型，In-cell ELISA需要将微孔板中培养的细胞进行固定和通透化，然后再用抗体原位检测。ELISPOT有点像蛋白印迹Western blot，先在带膜的微孔板中培养细胞，然后在膜上检测细胞分泌的抗原形成斑点。此外，我们还需要根据自身需要选择96孔板或是384孔板进行ELISA实验。
通常人们使用双抗夹心法进行ELISA实验，双抗夹心法中抗原被夹在捕获抗体和检测抗体之间，这种方法既灵敏又有效，受到了许多研究者的青睐。不过有时候双抗夹心法并不是最佳选择，例如有时候抗原特别小让两个大抗体难以附着，又或者抗体只有一个抗体结合位点。在上述情况下，竞争性ELISA就更为适用，这种方法是采用带标记的纯化抗原与样本中无标记的抗原进行竞争，以结合捕获抗体。
抗体类型
单克隆抗体和多克隆抗体都能够用于ELISA，实际上有时候二者结合效果更好。例如，对于双抗夹心法而言，用多抗进行捕获而单抗进行检测有时更有帮助。多抗能够确保捕获所有抗原，随后单抗再特异性检测拥有特定抗原表位的抗原。
双抗夹心法ELISA中捕获抗体与检测抗体(不论多抗还是单抗)的配对很有讲究。我们不希望捕获抗体与检测抗体竞争抗原上的同一位点，为此我们就需要确保捕获抗体和检测抗体所识别的抗原表位不存在重叠。如果捕获抗体和检测抗体之间发生了冲突，就会对实验结果产生较大影响。要避免这一问题，我们可以选择购买 “matched pair”的捕获/检测抗体对，这些打包在一起的抗体是商家经过验证才推荐的好组合，
交叉反应
如果抗体间发生冲突或交叉反应就会影响整个实验的特异性。其中抗体来源所带来的兼容性就是交叉反应的一个因素。尽管现在购买源自指定动物的抗体越来越容易，我们仍有必要确认一下是否会产生交叉反应的问题。在用双抗夹心法进行ELISA检测时，检测用的二抗必须特异性针对检测一抗，而不能与捕获抗体起反应。如果检测用二抗与捕获抗体结合，实验特异性就会大打折扣。通常我们选用源自不同宿主的捕获抗体和检测一抗，来避免上述问题。
与此同时，了解试剂盒中提供的buffer也是有必要的(例如washing buffer和blocking buffer)，以免这些buffer含有可能影响抗原抗体相互作用的组分，使检测结果收到影响。
检测方式
如今检测ELISA有许多途径，我们可以根据自己的偏好进行选择。一般ELISA检测的是酶促反应的可溶性产物，抗体上结合有相应的酶(例如通常使用的辣根过氧化物酶HRP)，而反应体系中添加有相应的底物(如3，3-二氨基联苯胺DAB)。这种酶促反应生成具有特征性的颜色，可以通过分光光度计进行检测，碱性磷酸酶AP也是一种常用酶。酶可以结合在一抗上，也可以结合在二抗上，还可以使用链霉亲和素标记的酶与亲和素标记的一抗结合。此外ELISA的结果检测还包括放射性检测、荧光检测、化学发光或显色法检测等。
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