ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)操作步骤

【操作步骤】

A、组织细胞样本的常规操作

1、制备细胞悬液: 新鲜组织经过胰蛋白酶或胶原酶等消化处理，通过适当方法制备成细胞悬液，离心弃上清。

2、裂解：加入3～5倍细胞沉淀体积的ACK Lysis Buffer，轻柔吹打混匀，裂解1～2min。本操作步骤在4℃条件下操作更佳，亦可在室温下操作。

3、离心：4℃，400～500g离心5min，弃红色上清。如无低温离心机本步骤亦可在室温下操作。

4、如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3各一次。

5、洗涤：根据具体实验要求加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，轻柔混匀重悬沉淀。4℃，400～500g离心2～3min，弃上清，离心步骤亦可在室温下操作。所加入的PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液的量一般应大于细胞沉淀体积的5倍以上。

6、如有必要，重复上述步骤5一次，共洗涤1～2次。

7、根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀，进行计数、培养等后续实验。

B、组织细胞样本的快速操作(无需洗涤)

1、制备细胞悬液：新鲜组织经过胰蛋白酶或胶原酶等消化处理，通过适当方法制备成细胞悬液，离心弃上清。

2、裂解：加入细胞5倍细胞沉淀体积的ACK Lysis Buffer，轻柔吹打混匀，裂解1～2min。本操作步骤在4℃条件下操作更佳，亦可在室温下操作。

3、加入15～20ml的 PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，轻柔混匀。

4、离心：4℃，400～500g离心5min，弃红色上清，本步骤亦可在室温下操作。

5、如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2～4各一次。

6、根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀，进行计数、培养等后续实验。

C、血液样本的常规操作

1、取新鲜抗凝血，400～500g离心5min，离心弃上清。

2、裂解: 加入6～10倍细胞沉淀体积的ACK Lysis Buffer，轻柔吹打混匀，裂解1～5min。本操作步骤在4℃条件下操作更佳，亦可在室温下操作。(特别提醒：对于鼠的血液，裂解1～2min已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4～5min，并且裂解过程中轻轻摇动以促进红细胞裂解)

3、离心：4℃，400～500g离心5min，弃红色上清。如无低温离心机本步骤亦可在室温下操作。

4、如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。

5、洗涤：根据具体实验要求加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，轻柔混匀重悬沉淀。4℃，400～500g离心2～3min，弃上清，离心步骤亦可在室温下操作。所加入的PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液的量一般应大于细胞沉淀体积的5倍以上。

6、根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀，进行计数、培养等后续实验。

注意： 对于微量或少量的血液样本，可以不用第1步操作，加入10倍血液体积的ACK Lysis Buffer进行第2步操作，并在4℃或室温裂解4～15min。对于鼠的血液，裂解4～5min已经足够;对于人的外周血，宜延长裂解时间至10min，但通常不宜超过15min，并且裂解过程中宜适当摇动以促进红细胞裂解。

D、血液样本的快速操作(无需洗涤)

1、新鲜抗凝血中加入10倍体积的ACK Lysis Buffer，轻轻吹打混匀，裂解4～15min。本操作步骤在4℃条件下操作更佳，亦可在室温下操作。(特别提醒：对于鼠的血液，裂解4～5min已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至10min，但通常不宜超过15min，并且裂解过程中宜适当摇动以促进红细胞裂解。

2、加入20～30ml PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，轻柔混匀。

3、400～500g离心5min，弃红色上清。4℃离心效果更佳。

4、如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。

5、根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀，进行计数、培养等后续实验。
 

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