酒石酸酸性磷酸酶染液操作步骤

中文名称：酒石酸酸性磷酸酶染液

细胞和组织的酸性磷酸酶染色主要由萘酚、六氮化对品红、亚硝酸钠等组成,染色后酶活性部位呈红色。

酸性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)以萘酚AS-BI为底物，在酸性pH下被酸性磷酸酶水解释放出磷酸和萘酚，萘酚与重氮盐偶联生成有色产物，定位于细胞质中。对某些酸性磷酸酶来讲，Cu2+、酒石酸根离子和四氯化碳以及醛类也都是抑制剂，Mn2+为该酶的激活剂。多用于新鲜血涂片、细胞涂片、冰冻切片等。

【产品介绍】抗酒石酸酸性磷酸酶主要存在于正常人肺泡巨噬细胞等部位的TRAP和存在于细胞白血病人脾脏TRAP均在细胞滤泡中，并不释放入血液，血液中TRAP绝大部分来源于破骨细胞。因而测量血液中TRAP可以了解破骨细胞的功能状态。

【染色原理】在碱性的缓冲液中，细胞内酸酸性磷酸酶催化底物水解，其生成物进而与一种稳定的重氮盐偶联，生成不溶性的偶氮染料沉淀，当底物中存在酒石酸时，该反应只出现在特异性细胞中。

【染色结果】阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位胞浆。

【产品优点】

① 磷酸酶系列染色液为重氮偶联法，染色效果好，磷酸酶的特异性反应沉着于胞浆当中，形成红色或红棕色的颗粒沉淀。再通过核染色液的复染色，对比度清晰、分明。

 ② 染色液无嗅、无味、无刺激、不脱色，不含有毒性的物质，对人体无伤害。 ③ 操作步骤简单，只需固定—底物液孵育—复染三步，省时、准确、操作简便。 ④ 染色建议使用水性介质-甘油明胶进行封片固定。⑤ 该磷酸酶系列染色液均使用进口原料，质量保证，价格低廉，特别是抗酒石酸酸性磷酸酶染液，为国内独家生产，物美价廉。

【所需仪器】光学显微镜、玻片、染缸、滴管、秒表、记号笔等。

具体试剂配制及操作：

一、固定液：液体，40ml×1瓶

新鲜血涂片、细胞涂片或爬片、冰冻切片用固定液固定5～10min。石蜡包埋的切片经脱腊后不需要再固定。

二、底物反应液(一)、(二)、(三)、(四)的组成及配制：

●底物反应液(一)组成及配制

组成：(1)A粉×1支    (2)B液500ul×1支

(3)C粉×1支    (4)D液500ul×1支

配制：临用前将B液用移液器吸入A粉中充分溶解配成甲液，备用

再将D液移液器吸入C粉中充分溶解配成乙液，备用

zui后将甲液与乙液混合成底物反应(一)，备用

●底物反应液(二)组成及配制：

组成：(1)E粉×1支    (2)F500ul×1支

配制：临用前将底物反应液二的F液移液器吸入E粉中充分溶解配成底物反应液(二)，备用。

●底物反应液(三)：G液1ml×1支，备用

●底物反应液(四)组成及配制：

组成：(1)H粉×1支    (2)I液500u l×1支

配制：临用前将I液移液器吸入H粉中充分溶解配成底物反应液四，备用

底物孵育液的配制：

染色缸染色孵育法：

①将底物反应液(一)、(二)、(三)、(四)的备用液混合并充分混匀，

②先在染缸内加30 ml蒸馏水，37℃水浴10分钟，

③将底物反应液(一)、(二)、(三)、(四)依次加入已预温的蒸馏水中，

④然后将样本玻片固定,水洗后还末完全干前,，立即将样本玻片放入已准备好的反应孵育液中，避光孵育60分钟。

三：复染液：苏木素液，10ml×1瓶

甲基绿液，10ml×1瓶

孵育完后，取出水洗1分钟，在玻片尚未完全干之前进行复染。

可用苏木素复染1-2分钟，或用甲基绿复染2～3分钟，两者取其一

样本染色前处理及染色：

血涂片及骨髓涂片

1、推片：取全血或骨髓3微升左右置载玻片上，将推玻片保持与载玻片30度角，置于血滴正前方，稍往后移与血滴接触，血滴沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动，至血液铺完血膜为止。满意效果为不太薄，以免细胞太少，也不要太厚，以免太重叠。

2、凉干：使涂片在空气中自然凉干，再放入本试剂盒中的固定液内固定2~3分钟，水洗约30~60秒。

3、一定注意水洗后不要太干时放入底物液中孵育60分钟（太干后染色效果欠佳）。

石蜡切片

1、二甲苯中脱蜡5~10分钟。再换用新鲜的二甲苯，脱蜡5-10分钟。

2、无水乙醇5分钟。再90%、70%乙醇各2分钟。

3、水合：蒸馏水2分钟。

冰冻切片

1、回温：将预先制好的并保存在-20℃冰箱中的冰冻切片放置到切片架上回温【注】 约5-10分钟。

【注】：
1）可放到37℃孵箱中进行回温;

2）在37℃水浴箱中放置一个小盒子，再将从冰箱中取出的切片架放到小盒当中，目的是让冰冻切片回温到37℃。

2、水合：将回温好的切片，水中浸泡1~2分钟。

注意事项：

1、如样本为骨片的石蜡切片，要注意不可用硝酸脱钙，酸脱钙的方法对蛋白质（酶类）伤害较大，从面影响特异性酶染色，会使细胞中的特异性酶失活，导致酶不能跟底物结合，从而导致染色失败。建议使用抗酒石酸酸性磷酸酶专用的试剂进行脱钙，本公司有售，咨询。

2、用底物孵育液进行孵育时要注意避光。

染色结果：阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位胞浆。