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免疫细胞化学技术

人阅读 发布时间:2016-12-27 15:59

由上海乔羽生物提供,仅供参考!

免疫细胞化学,又称免疫组织化学,其主要原理是用标记的抗体或抗原对细胞相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测,经过化学的呈色反应后,用显微镜或电子显微镜观察。

该技术是免疫荧光技术与形态学技术结合的产物。

1 概述
    1.1 抗原和抗体的要求
    1.2 抗原 (antigen, Ag)
    1.3 抗体 (antibody, Ab)
2 标本的制备
    2.1 石蜡切片
    2.2 冰冻切片
    2.3 组织印片
    2.4 细胞培养片(细胞爬片)
    2.5 细胞涂片
    2.6 细胞涂片 (续)
3 常用染色方法
    3.1 免疫荧光法

一、免疫细胞化学技术的概述
免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)——是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究。

(一) 对抗原和抗体的要求上海樊克   免疫细胞化学法
¨ 具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
– 对抗体的要求:纯度高、比活性强;
¨ 高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。
– 对抗原的要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。

(二) 抗原 (antigen, Ag)
¨ 抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:
– 免疫原性:引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性;
– 免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
¨ 根据抗原是否显示免疫原性分为:
– 完全抗原:分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。
• 免疫原性最强的是蛋白质抗原,多糖次之;脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
– 半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。
• 半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。

载 体
¨ 通常是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
– 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。
– 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5~25个分子的小肽。
(三)抗体 (antibody, Ab)

1、抗体的概念:
¨ 机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。
– 抗体主要存在于血清内;
– 抗体都是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
– 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。
¨ 单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
– 特异性强、抗体产量高。
¨ 多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
– 特异性低,会产生抗体的交叉反应。
– 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。
– 抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
¨ 动物的选择  
¨ 佐剂(adjuvant)
¨ 免疫方法
¨ 免疫剂量
¨ 抗体效价的测定
¨ 放血或定期抽血
(1) 动物的选择

选择什么动物来免疫取决于:
¨ 所需抗血清的量
– 小鼠只能提供1.0~1.5ml的血液,而山羊能提供几升。
¨ 能供免疫用的抗原量
– 小鼠50mg足够,而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)
¨ 动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
– 例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
– 常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔(新西兰兔,年轻,健壮,体重在2.5kg左右,雄性)为最常用。

标本的制备
石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法
· 石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响,但可通过某些措施予以改善,因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。
1、取材的特殊要求及注意事项
· 标本新鲜:一般在2h以内进行,超过2h,组织将有不同程度的自溶,其抗原或变性消失,或严重弥散。
· 取材部位:除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区,以形成自身对照。
1、取材的特殊要求及注意事项(续)
· 避免挤压:取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色,因而取材时应使用锋利的刀刃;
2、固定及常用的固定液
· 取材后的组织需立刻投于固定剂中
· 常用固定液:固定剂品种很多,但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同,各有优缺点。
(1) 醛类
· 甲醛(福尔马林)应用最广
· 甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;
· 醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍;
· 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
· 戊二醛:
· 多聚甲醛(常用4%):
· 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2) 醇类
· 最常用的醇类固定剂是乙醇。
· 脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量,因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
· 乙醇使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。
(3) 其它固定剂
· 丙酮:
3、抗原修复——原因
· 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定,结果使得:
· 要求:在染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。
3、抗原修复——方法
· 化学方法
· 加热方法
(1) 化学方法
· 主要是通过一些酶的作用,使抗原决定簇暴露。常用的酶有:胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
· 例如:Laminin、CollagenIV
(2) 水浴加热法
· 将玻片放入装有抗原修复液的容器中,加热至沸腾,持续10~15分钟。
(3) 微波照射法
· 将玻片放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95℃以上,持续l0~15分钟,冷却后,按免疫组化染色步骤进行。
· 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动,撞击交联的网链,使抗原异常的构想恢复正常,且因分子运动产热、效率高、时间短,对抗原再现效果好。
(4) 高压加热法暴露抗原
· 将玻片浸入抗原修复液内,置高压锅中高压2~3min,可取得极好的效果。
· 由于高压下受热均匀,特别使用于大批量标本的染色。
(1) 酸水解法
· 酸水解可使交联断裂、暴露抗原。
· 将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中,室温作用20min(温度升高,作用时间缩短)。
· 此法能增强特异性染色,降低背景,但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。
加热法的注意事项
· 达到规定的温度(92~95C以上);
· 维持一定的时间;
· 避免切片干涸 (抗原可能完全丢失);
· 加热后必须经过室温自然冷却20~30分钟,使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型;
· 修复液:
4、载玻片的处理
· 抗原修复过程中,由于高温、高压等诸多固素的影响,极易造成脱片。为防止脱片,常用粘附剂处理载玻片。
· 常用的粘附剂有:
APES(3-aminopropyltriethoxysilane)
3-氨丙基三乙氧基硅烷
· 现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);
· 将洗净的玻片浸于此液中20~30秒钟;
· 取出稍停片刻,再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES,置通风橱中晾干或60C烤箱烤干。
Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)
· 将清洁玻片浸于100g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释),37C放置30min,然后60C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。
铬明胶溶液
· 试剂:铬明矾(chrome alum) 0.25g
明胶(gelatine) 2.5g
蒸馏水 500ml
· 先将铬明矾溶解于40C少量蒸馏水中,再加入明胶及蒸馏水,可在70 C水浴中使明胶溶化,搅拌均匀后,即可使用。如有残渣,可过滤后再用。
· 用时稍加溶化,切片浸入2~3min,过夜晾干。
冰冻切片
· 冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。
· 在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。
· 对稳定性差的抗原,如淋巴细胞表面抗原尤其适合。
· 组织冻结过程中,细胞内、外的水分会形成冰晶,冻结的速度愈慢,冰晶颗粒愈大,可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。
1、冰冻组织块的常用方法
· 液氮中冰冻:组织投入液氮中 (一196C)中10~20sec;
· 干冰中加入丙酮(或异戊烷),液体立即气化起泡,温度降至一70C ,将组织投入,若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器,组织投入该容器内结冻则更好;
2、切片
· 供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整,并有连续性。
· 载玻片也应清洁无油污,但一般无需涂抹粘附剂;
· 切片时,使用恒温冷冻切片机,在箱内温度-25 C 。切片厚度一般为4~8m。
3、切片后处理
· 切好的冰冻切片,室温下自然晾干1~2h后,入4C丙酮固定10min,待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
· 冰冻切片由于切片技术要求较高,不易得到连续性很好的切片,其形态结构亦不如石蜡片,且冻块和切片不便于长期贮存,因此冰冻切片的应用受限。
组织印片
· 将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面,细胞即粘附于玻片,晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min,自然干燥后染片或-20℃保存。
细胞培养片(细胞爬片)
· 贴壁细胞培养时,置盖片于培养瓶中,使细胞在盖片上生长,达适当密度后取出固定(丙酮-20C固定10~20min),再进行免疫染色。
细胞涂片
· 大多数细胞涂片由细胞悬液制成,包括:
细胞涂片 (续)
· 细胞涂片的方法:
· 将细胞浓度调节到106/ml左右,可直接涂于载玻片上,但要均匀、不重叠。
· 图片范围应小于1cm直径,以节约试剂。
· 将细胞样品制成2×105~6/ml 细胞悬液,吸取50~100l (1~2×104~5cells) 加入涂片机内,1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。
常用染色方法
根据标记物的不同分为免疫荧光法、免疫酶标法、亲和组织化学法。
免疫荧光法
【原理】
· 用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素,可标记抗体或抗原;
免疫荧光技术
免疫荧光技术
· 荧光素经某种特定波长的光照射激发后,能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光,籍此可作定位观察或示踪;
· 借助于荧光显微镜进行观察。
1、常用的荧光素
· (1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)
· (2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)
· (3) 四乙基罗丹明 (RB200)
· (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)
(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)
· 易溶于水和乙醇。
· 最大吸收光谱为490~495nm,最大发射光谱为 520~530nm.呈翠绿色荧光,分子量 389.4。
· 在碱性条件下,FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键,成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。
(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
· 最大吸收光谱550nm,最大发射光谱620nm,呈红色荧光,分子量为444。
· 与蛋白质结合的方式同FITC。
(3) 四乙基罗丹明(RB200)
· 不溶于水,易溶于乙醇和丙酮。
· 最大吸收光谱为570nm,最大发射光谱为595~600nm,呈橙红色荧光,分子量为580。
· RB200在五lvhualin(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl),在碱性条件下,易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分子上。
(4) 碘化丙啶(PI)
· 是常用的DNA荧光标记探针,可作为FITC的胞核对比染色。
· PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合,但对碱基无特异性选择。
· 最大吸收光谱是493nm,最大发射光谱是630nm,呈红色荧光。
2、荧光抗体的保存
· 一要防止抗体失活,二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭。
3、免疫荧光的染色方法
· 免疫荧光染色法常用的有
原理:将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。
直接免疫荧光法的操作步骤
· 标本的处理:
直接免疫荧光法的操作步骤(续)
· 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次,不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
· 缓冲甘油封片
直接免疫荧光法的注意事项
· 对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度;
· 一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。
直接免疫荧光法的注意事项 (续)
· 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化;
免疫酶酶标法
【原理】
· 以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素,沉积于抗原和抗体反应的部位;
· 酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。
· DAB本身无色,反应后呈棕色,不溶于水,不易褪色,电子密度高,最为常用。
· 目前已经有商品化的试剂盒,使用起来非常方便。
2、常用的免疫酶染色方法
· 又分为以下两种方法:
– 酶标抗体法
· 直接法
· 间接法
– 非标记抗体酶法
· 酶桥法
· PAP法
(1) 酶标抗体法
· 通过共价键将酶结合在抗体上,制成酶标抗体,与标本进行反应后,再用酶组化法将酶显色,使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,以供光镜和电镜观察。
(1) 酶标抗体法——直接法
· 将酶直接标记在一抗上,然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物,最后用底物显色剂显色。
(1) 酶标抗体法——间接法
· 将酶标记在二抗上,先将一抗与相应的抗原结合,形成抗原抗体复合物,再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色。
酶标抗体间接法的操作步骤
· 标本准备:
· 石蜡切片需要进行抗原修复,其它标本则不用;
(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续)
· 封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2-甲醇溶液室温孵育5~10min (湿盒内) ;
· 0.01M PBST漂洗,5min×3;
· 5~10%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭,室温孵育30min (湿盒内) ;
· 倾去血清勿洗,加1%BSA(PBST配制)稀释的一抗, 37C孵育60min 或4C过夜(湿盒内);
(2) 酶标抗体间接法的操作步骤(续)
· 0.01M PBST漂洗,5min×3;
· 加HRP标记的二抗室温孵育lh或37C 30min ;
· 加0.01%H2O2~0.05%DAB显色 (显色液应新鲜配置);
· 经PBS漂洗3次后,梯度酒精脱水,二甲苯透明,明胶甘油封片,显微镜观察。
(2) 非标记抗体酶法——酶桥法
· 首先用酶免疫动物,制备效价高、特异性强的抗酶抗体;
· 以二抗作桥,将抗酶抗体联结在一抗上;
· 再将酶结合在抗酶抗体上,经显色显示抗原的分布
【原理】
· 生物素(biotin)又称维生素H,是一种小分子维生素,分子量为244,是转氨甲酰基化过程中的辅酶。
· 抗生物素(avidin),又称卵白素或亲和素,是一种分子量为67000的碱性蛋白,对生物素具有很强的亲和力,比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成,每个亚基都有生物素的结合位点。
· 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联,又可被酶类等多种示踪物所标记,形成生物素-抗生物素系统。
(1)标记抗生物素—生物素法(labelled avidin-biotin method, LAB):分为直接法和间接法。
· 直接法
用生物素标记第一抗体,与抗原结合;酶标记抗生物素,与生物素结合,然后进行酶呈色反应。
· 间接法
用生物素标记二抗,酶标记抗生物素,先用第一抗体与组织抗原结合,再将第二抗体与第一抗体相连结,最后进行呈色反应。
(2)桥抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method,BRAB)
– 此法是用生物素分别标记抗体和酶,以抗生物素为桥,把二者连接起来,进行呈色反应。
(3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法
 

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