AgNOR 染色法：

1、试剂配制：

（1）AgNOR 染色液：

甲液：明胶 2 g 溶于双蒸水至 99 ml，在 60℃ 使之完全溶解，再加入纯甲酸 1 ml 摇匀待用。

乙液：硝酸银 50 g 溶解于双蒸水中至 100 ml，4℃ 冰箱保存。

（2）AgNOR 工作液

取甲液 10 ml，乙液 20 ml 临用前混合。

2、步骤：

（1）切片脱蜡至水

（2）双蒸水洗 2 次

（3）AgNOR 工作液中（25℃）浸染 30 分钟（暗处进行）（镜下观察）

（4）双蒸水洗 3 次

（5）脱水, 透明, 封固

3、结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR 呈棕黑色颗粒状。

B

鞭毛染色法:

１．试剂配制：

甲液：丹宁酸 ５克，氯化铁（FeCl3）１．５克，福尔马林（15％）２．０毫升，氢氧化钠（ＮａＯＨ）１％ １．０毫升

乙液：硝酸银（ＡｇＮＯ3）２克

蒸馏水 100 毫升

制备乙液时，待硝酸银溶解后，取出１０毫升备用，向余下的９０毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，先呈很浓厚的沉淀，再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈现薄雾，但轻摇则消失，继续边滴加边摇动，待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。

２．染色方法：

（１）将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上，置３７°培养１６—２０小时，备用。

（２）在载玻片的中部相隔一厘米处，用接种环各沾一滴蒸馏水，然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中，倾斜玻片使培养物流至另一水滴中，两水滴自然相通，菌体从上位自然扩散到下位水滴中，待干燥后染色。

（３）在干燥涂片上加甲液３—５分钟，用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液保持３０—６０秒钟。染色时在酒精灯上稍加热，使染液出现蒸汽即可，用蒸馏水冲洗。

（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。

３．注意事项：

（１）染液最好随用随配，存放至次日效果则差。

（２）一定要充分洗净甲液后再加乙液，否则背景较脏。

（３）防止水及培养物沾有氯化物。

（４）切忌用接种环涂抹培养物。

（５）载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸，再水洗，干后放在洗液中，浸泡 24 小时，取出水洗除去残酸，沥干，存放于９５％ 乙醇中备用。

（６）加热时最好置金属板上，使载玻片受热均匀。

β－半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。

β－半乳糖苷酶的活性可以用 X-gal（5-溴－4-氢－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）等显色底物加以检测，β－半乳糖苷酶可将 X-gal 转变为不溶性的深蓝色沉淀。

X-gal 可以做为组织染色剂，可以在所有表达β－半乳糖苷酶的植物和动物组织上产生颜色。

应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。

C

CAE 染色步骤

1、试剂配制：

（1）A 液：萘酚-AS—D 氯醋酸 10 mg 溶于 N,N-二甲基甲酰胺 1 ml 中。

（2）4％ 副品红液：取盐酸副品红 (EM 级)1 g，溶于蒸馏水 20 ml 内，再加入 10m1／L 的 HCl 5m1，稍加温以增加溶解度，过滤、贮室温下。于使用前，取等量副品红液与新鲜的 4％ 亚硝酸钠混合，之后用淀粉碘化物试纸测试，瞬间试纸应变为蓝色才合格，如果不变色，应加入更多的亚硝酸盐。

（3）B 液：o．1mol/L 的 Michaelis Veronal-醋酸缓冲液 (PH 7.6)30 ml，加入新配制的副品红液 3 滴，用 1moI／L HCl 使 PH 值调至 6．3。

2、染色步骤：

（1）将 A.、B 二液混合，过滤，加入氟化钠 (17 mg/10 ml), 使之最后浓度为 0.04mol/L.

（2）切片置于上述溶液内孵育 1 h(30℃)

（3）流水冲洗。

（4）苏木素复染。

（5）空气干燥后封固。

G

Grimelius 硝酸银反应法（嗜银反应）:

1、试剂配制：

硝酸银液: 1% 硝酸银水溶液 3 毫升 蒸馏水 87 毫升

0.2M 醋酸缓冲液 (PH5.6) 10 毫升

还原液: 对苯二酚 1 克 亚硫酸钠 5 克 蒸馏水 100 毫升

2、染色步骤:

（1）切片脱蜡至蒸馏水

（2）60℃ 硝酸银液内 3 小时

（3）用滤纸吸去周围银液, 蒸馏水速洗

（4）入 45℃ 的还原液处理 1 分钟

（5）蒸馏水洗

（6）5% 硫代硫酸钠处理 1 分钟 (可不做)

（7）水洗, 脱水, 透明, 封固

3、结果：嗜银颗粒呈棕黑色。正常时嗜银颗粒存在于神经内分泌细胞，故此法主要用于神经内分泌肿瘤的诊断。

H

HID 染色法

1、染色步骤:

（1）切片脱蜡至蒸馏水

（2）放入预热的 1 当量盐酸中 10 分钟

（3）蒸馏水洗

（4）Schiff 液中染 10 分钟

（5）自来水洗 15 分钟至细胞核红色（如 2～5 步不做，可在染好爱先蓝后染核固红 2 分钟）

（6）蒸馏水洗

（7）高铁二胺液 18～24 小时

（8）爱先蓝液 (pH2.5) 染 10～20 分钟

（9）蒸馏水洗

（10）脱水, 透明, 封固

2、结果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色, 羧基化酸性粘液（唾酸粘液）物质蓝色。硫酸化酸性粘液可见于大肠粘膜，而小肠粘膜仅出现唾酸粘液，此法多用于确定肠化的分型。

HP（硝酸银法）

1、试剂配制：

（1）醋酸缓冲贮备液，PH3.6

0.2N 醋酸缓冲液，PH3.6 10 ml

蒸馏水 240 ml

以下各液均用此液配制

（2）1 % 硝酸银液

硝酸银 1 g

醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml

（3）2 % 硝酸银液

硝酸银 0.2 g

醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml

（4）5 % 明胶液

明胶 5 g

醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml

先把醋酸缓冲贮备液加温至 40℃ 左右，然后倾入明胶，于 37℃ 温箱内慢慢溶解，搅拌。

（5）3 % 对苯二酚液

对苯二酚 0.3 g

醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml

（6）明胶对苯二酚液

3 % 对苯二酚液 1 ml

5 % 明胶液 15 ml

（7）显影液

明胶对苯二酚液 16 ml

2 % 硝酸银液 3 ml

在操作到第 4 步完成前 5 分钟充分混合，置于 56℃ 水浴箱中保温待用。

2、操作方法：

（1）组织脱蜡至蒸馏水

（2）醋酸缓冲贮备液洗 2 次

（3）入 1 % 硝酸银液中，56℃，1 小时

（4）切片不水洗，直接放入预热的显影液中 56℃，肉眼呈黄棕色为止。

（5）倾去显影液，于 56℃ 的水中浸洗 2 分钟

（6）水洗

（7）脱水，透明，封固。

3、结果：幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。

Highman 甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）

1、试剂配制：

甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml

碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80% 乙醇 100 ml

2、染色步骤:

（1）切片脱蜡至水

（2）甲醇刚果红染液染 10～20 分钟

（3）用碱性乙醇分化液分化数秒

（4）水洗

（5）苏木素复染 2 分钟

（6）水洗

（7）脱水, 透明, 封固

3、结果：淀粉样物呈桔红色。

4、类淀粉染色的应用：

确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，常用于诊断甲状腺髓样癌和胰岛细胞瘤等。

L

六胺银染色法

1、试剂配制：

六胺银液配制：

3% 六次甲基四胺水溶液 5 ml

2.5% 硝酸银水溶液 0.5 ml

摇晃，变清，再加 2.5% 四硼酸钠 1.5~2 ml 加蒸馏水至 30~40 ml

2、步骤：

（1）切片脱蜡至水，蒸馏水洗

（2）0.5% 高碘酸浸 15 分钟，蒸馏水洗

（3）六胺银液 60℃，1-2 小时，（或六胺银液 80-90℃，半小时左右）蒸馏水洗（镜下基底膜呈黑色）

（4）0.2% 氯化金调色数秒

（5）丽春红淡染

（6）水速洗

（7）烘干，透明，封片。

3、结果：肾小球基底膜呈黑色，霉菌，弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。

M

Mallory 三色法

1、步骤

（1）切片脱蜡至水

（2）0.5% 酸性复红水溶液 1 min

（3）蒸馏水洗

（4）入下液 1-2 min

苯胺蓝 0.5 g，桔黄 G 2 g，磷目酸或磷钨酸 1 g，蒸馏水 100 ml。

（5）蒸馏水洗

（6）95% 乙醇分色

（7）脱水，透明，封片。

2、结果：胶原纤维蓝色， 红细胞桔黄色，核红色。

Mallory 磷钨酸～苏木素染色法（PTAH）

1、试剂配制：

苏木素 0.1 g 磷钨酸 2.0 g 蒸馏水 100 ml

先将苏木素加热溶于 20 毫升蒸馏水, 再将磷钨酸溶于 80 毫升蒸馏水。等苏木素冷却后，加入磷钨酸溶液，混合，放置数星期后，才可使用。如急用，可加入 0.2 g 高锰酸钾, 加速其成熟。

2、染色步骤:

（1）切片脱蜡至蒸馏水。

（2）放入 0.25% 高锰酸钾水溶液 5 分钟。

（3）蒸馏水洗。

（4）2.5% 草酸漂白 5 分钟。

（5）蒸馏水洗多次。

（6）置于磷钨酸苏木素溶液 12～24 小时。

（7）95% 酒精快速分化，滤纸吸去剩余酒精，置 60℃ 温箱中烘干。

（8）二甲苯透明，封固。

3、结果：纤维胶质，肌胶质，神经胶纤维，纤维素，横纹肌等均染成蓝色。胶原，网状纤维和骨基质着黄色或砖红色。在工作中常用于观察横纹以证实肿瘤细胞是否有横纹肌分化特征。

Masson 三色染色法

1、试剂配制：

丽春红酸性品红液： 丽春红 0.7 g 酸性品红 0.3 g

蒸馏水 99 ml 冰醋酸 1 ml

苯胺蓝液: 苯胺蓝 2 g 蒸馏水 98 ml 醋酸 2 ml

亮绿液： 亮绿 0.2 g 蒸馏水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml

苦wei酸酒精液: 苦wei酸在 95% 酒精中的饱和液 20 ml, 加 95% 酒精 10 ml

2、染色步骤：

（1）切片脱蜡至蒸馏水

（2）苏木素染 5～10 分钟

（3）盐酸酒精分化

（4）流水蓝化，蒸馏水洗 (苏木素可不染)

（5）丽春红酸性品红液中染 5～8 分钟

（6）蒸馏水洗

（7）1% 磷钼酸中染 1～3 分钟

（8）不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液 5 分钟 (如染色效果不佳, 可在冰醋酸内脱色后重染)

（9）水速洗，置 60℃ 温箱中烘干，二甲苯透明, 封固

3、结果: 胶原纤维蓝色（苯胺蓝复染）或绿色（亮绿复染）, 肌纤维、纤维素红色。

4、注意：

（1）此法广泛用于胶原纤维和平滑肌的鉴别，也为肾组织活检，观察肾小球病变的重要染色法，常用于观察缺血病变的心肌。 用于观察肾小球病变时，一定要用 2um 以下半薄切片。

（2）细胞核染色后分化很重要，观察控制着色程度。而 HE 染色则是最常用的一种常规染色方法，但无法区别胶原纤维和肌肉。

N

粘液染色

（一）PAS 染色法

与染糖元的方法相同。

（二）AB(pH2.5) 染色法

1、试剂配制：

爱先蓝 8 GX 1 g 蒸馏水 97 ml 冰醋酸 3 ml

核固红液: 核固红 0.1 g 硫酸铝 5 g 麝香草酚 50 mg 蒸馏水 97 ml

2、染色步骤:

（1）切片脱蜡至蒸馏水。

（2）爱先蓝液染 10～20 分钟

（3）蒸馏水洗

（4）核复染 (核固红 5 分钟)，水洗

（5）脱水, 透明, 封固。

唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈蓝色。常用于确定胞浆内空泡的性质，特别是当细胞呈现印戒样特征时。

J

甲基绿派洛宁法（改良 Cook，1974）

1、试剂配制：

（1）2% 甲基绿水溶液：

甲基绿（methyl green）1 g

蒸馏水加至 50 ml

用三氯jia烷抽提，方法详后。

（2）5% 派洛宁水溶液：

派洛宁 G（pyronine G）1 g

蒸馏水加至 20 ml

（3）0.2M 醋酸盐缓冲液（pH 4.8）

0.2M 醋酸液 41 ml

0.2M 醋酸钠液 59 ml

（4）甲基绿派洛宁染液：

2% 甲基绿水溶液（经抽提）5 ml

5% 派洛宁水溶液 1 ml

蒸馏水 12 ml

0.2M 醋酸盐缓冲液（pH 4.8）18 ml

甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用，甲基绿就比甲基绿后，所引进的甲基连接得并不牢固，容易从甲基绿中脱失。另一方面，在甲基化过程中，还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿，因此，也有人认为甲中，常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是，也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物，甲基绿在储存过程中，会不断产生甲基紫。因此，在配制试剂时，必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来，才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取 2% 甲基绿水溶液 20 ml 倾入洁净分液漏斗，加入三氯jia烷 20 ml 充分摇荡混合，使其内的甲基紫溶于三氯jia烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把如此反复更换三氯jia烷，直到三氯jia烷无紫红色为止，即可得到得纯的甲基绿溶液。

2、操作步骤：

（1）新鲜组织固定于 Carnoy 氏液（4℃）3~6 小时，经 95% 酒精和无水酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

（2）切片经二甲苯脱蜡至蒸馏水。

（3）置入甲基绿派洛宁染液于室温染 30~60 分钟。

（4）取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。

（5）用丙酮迅速分化。

（6）转入丙酮二甲苯（1:1）稍洗。

（7）二甲苯透明 2~3 次。

（8）中性树胶封固。结果：存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色，胞核染色质内的脱氧核糖核酸绿色或绿蓝色。

3、对照方法：

（1）取另一连续切片用核糖核酸酶（rihonuclease）1 mg/1 ml 于 37℃ 温箱内消化 3 小时，蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。

（2）切片在 10% 高氯酸（prechloric acid）于 4℃ 处理 12~18 小时，水洗后用 1% 碳酸钠液中和 2 分钟，流水冲洗 5 分钟，再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。经上述方法之一处理后的切片就为阴性。

4、注意事项：

（1）组织不宜用甲醛固定，应选用 Garnoy 氏固定液，因为酒精和醋酸能较好地保存核蛋白。

（2）Garnoy 氏液固定标本的时间不宜太长，超过一天则染色效果不理想。

（3）要注意试剂的质量，特别是派洛宁，常常不同批号的染料，染色的效果不同。甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当。

（4）染色液的 pH 应为 4.8 左右，如 pH 过低，甲基绿染色效果差；pH 偏高，则派洛宁染色效果不良。

（5）丙酮分化时间要很好掌握，时间不宜太长。

（6）配妥的甲基绿派洛宁染液用后放冰箱保存，约可使用数周。

染色原理：对此法的染色原理，目前了解得还不够清楚，一般可从下面两方面理解。

（a）电离作用：脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有碱基，故为两性电解质。在一定的条件下，可以电离而带电荷，因此都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后，都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后，在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱，在染色时二者进行竞争，碱性较强的甲基绿就与胞核（等电点 pH3.8~4.2）进行极性吸着而结合，碱性较弱的派洛宁与胞质（等电点 pH4.6~5.2）吸附结合。

（b）聚合作用：甲基绿对聚合高的 DNA 有亲和力，派洛宁对聚合低的 RNA 有亲和力。因此，思虑在绿选染 DNA，而派洛宁选染 RNA。应用：PNA 主要存在于胞质及核仁内，它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生，胞质蛋白质合成亢进时，核仁和胞质的 PNA 增加。因此，恶性瘤细胞核仁巨大，胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白，胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此，这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱，是蛋白质合成增强的标志。

S

脂肪（苏旦Ⅲ）法

1、试剂配制：

苏旦Ⅲ 0.1～0.2 70% 酒精 100 ml

将苏旦Ⅲ置于 70% 酒精中, 加热饱和, 在未冷前过滤, 静置一夜。

2、染色步骤：

（1）冰冻切片（8～10 微米）。

（2）70% 酒精固定 1 分钟。

（3）放入苏旦Ⅲ酒精溶液中 20～30 分钟。

（4）70% 酒精洗去多余的染料。

（5）水洗。

（6）苏木素复染 2～5 分钟。

（7）1% 盐酸酒精分化。

（8）水洗，蓝化, 甘油封固。

3、结果：脂肪桔黄或红色。一般用于确定胞浆内空泡究竟是糖原，水变性还是脂滴。

P

高碘酸-六胺银-马休黄染色法 (PASM-M)

1、试剂配制：

六胺银原液： 3 % 六甲基四胺水溶液 (乌洛托品) 20 毫升，5 % 硝酸银水溶液 10 毫升。

六胺银工作液：六胺银原液 30 毫升，双蒸水 20 毫升，5 % 硼砂 (四硼酸钠)2 毫升。

核固红液：核固红 0.1 克，5 % 硫酸铝 100 毫升加热溶解，贮存饱和液待用。

马休黄液：马体黄 0.5 克，无水酒精 98 毫升，磷酸 0.2 克。

2、操作方法：

（1）常规脱蜡至水

（2）0.5% 氧化 20 分钟

（3）蒸馏水洗 3 次

（4）浸入六胺银工作液中 2 小时左右 (恒温 58℃)

（5）蒸馏水洗 3 次

（6）0.2% 氯化金 1-2 分钟

（7）蒸馏水洗 2 次

（8）核固红染色 10-15 分钟

（9）马休黄染色 1 分钟

（10）放入温箱烤干，二甲苯透明，中性树胶封固

3、结果：肾小球毛细血管基膜呈黑色，背景和红细胞呈黄色，细胞核呈红色。

4、注意：

（1）六胺银工作液现配现用，只能用一次。

（2）第 3 步做完后可入 5 % 三氧化铬 (铬酸) 水溶液氧化 40 分钟，再用 1 % 亚硫酸钠除铬，背景可能效果更佳。

（3）马休黄主要是染红细胞。用无水酒精中脱水，黄色的背景就脱掉，可直接放入温箱或电吹风吹干，封片。

R

瑞氏－姬姆萨染色方法

1、试剂配制：

原料:

A: 瑞氏染粉 0.8--1 克；吉姆萨染粉 0.5 克

B: 甘油 33 ml

C：甲醇 500 ml

配法：将 A 放入研钵中，加入少量 B 研磨，再加入少量 B 磨，再加入少量 B 磨……倒出，将未溶部分，继续加入 B 磨……> 全溶，加入 C，或中间加入 C 亦可。

2、染色步骤：

滴数滴入玻片盖满标本，30 秒，再加入双蒸水或 PBS2-3 倍染 1-3 分中，倾去染液，水洗……封片。

T

Trypan blue（台盘兰）排斥实验：

细胞悬液 0.1 ml 加入 0.4% Trypan blue 生理盐水溶液 0.1 ml, 混匀后滴在血球记数板上。存活率 = 不着色细胞数/细胞总数 X100%

TTC 方法：

TTC 和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞，用来表示细胞的活力。配制多为 2％，染色要避光，37 度条件下，它是评价脑缺血损伤常用的指标。

V

Van Gieson 法

1、试剂配制：

（1）饱和苦wei酸水溶液（约 1.22%）150 ml

（2）1% 酸性品红 10 ml

（3）上述两种溶液用前混合在一起。

2、染色步骤：

（1）切片脱蜡至蒸馏水。

（2）苏木素深染。（10～15 分钟）

（3）Van Gieson 中染半分钟。

（4）蒸馏水洗。

（5）置 60℃ 温箱中烘干。

（6）二甲苯透明，封固。

3、结果：胶原纤维红色，肌纤维、胞浆、红细胞黄色。


4、建议：用稀释的 Van Gieson 液进行染色，不用 95% 的酒精分化，结果色泽鲜艳，而且着色均匀。