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怎样选择合适你实验需要的抗体呢?

发布时间:2018-09-06 09:09 |  点击次数:

当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候,如何选择适合我们实验需要的抗体,并恰当保存使用,是每个科研人员需要细心考虑的。抗体种类繁多,品牌众 多,技术参数不一,价格和质量更是相差甚大,如何购买到高质量价格合适的抗体,并准确地做出我们想要的结果,其中有很多细节需要注意。
 
一、怎样选择适合你实验需要的抗体?
1. 一抗选择要点
(1)确定抗体的名字,注意中英文名字、它名、亚型等信息。
(2)确定你的实验类型,Elisa,WB,IHC,ICC,还是FACS。一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型,如果抗体说明 书没有提及的应用类型,并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型,而仅是说明尚未经过此种实验验证,请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的 抗体。
(3)确定实验样本的种属,Human,Mouse,还是Rat。一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验,请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。
(4)样本蛋白的结构性质。了解样本蛋白的结构性质有助于选择zui合适的抗体,待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性,蛋白空间构象的改变,会影响抗体的免疫亲和反应。

(5)单多克隆抗体的选择。市面上的抗体还是以多克隆抗体为主,一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。

2. 二抗选择要点
(1)种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源,如一抗是小鼠来源,那二抗就买抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗,以与后面的SP结合反应,而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗,如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。
 
二、抗体的稳定性
1. 抗体的稳定性是自然界长期进化的结果。抗体是免疫系统中zui重要的分子之一,其稳定性是自然进化筛选的结果。在众多物种中,抗体分子形成了保守而稳定的结构。
2. 抗体分子的高Tm值。在室温下,甚至短时间温度达到50-60℃,抗体分子都能维持正确折叠,保持应有的活性。
3. 抗体的纯度。采用先进的抗体纯化技术,确保抗体产品的高纯度,保障其抗体产品的稳定性。
4. 抗体的浓度。高浓度的抗体产品可减少容器表面吸附造成的物质损失,高浓度的抗体稳定性更好,抗体产品中93%的浓度大于0.5mg/ml。
 
三、怎样确定抗体购买渠道和品牌?
国外著名抗体品牌的质量一般没问题,但价格较贵,而且很多抗体品牌本身不生产抗体,所以能找到OEM抗体生产商生产的原装进口抗体,随着网络技术的越来越普及,我们自己就可以通 过国内外的相关网站来检索,国外zui大的生物试剂查询网站:biocompare,国内zui大的生物试剂查询网站:丁香通,来查找我们所需要的产品资料。
 
四、怎样保存已获得的抗体?
抗体无论是保存还是运输都应尽可能地避免反复冻融,收到抗体后请根据实验的需要,对抗体进行分装,避免同一管抗体反复冻融(反复冻融会导致抗体空间结构变 性,导致多聚体形成,从而降低抗体的结合能力)。抗体保存得当与否,直接决定了抗体的活性和使用效果,如果抗体保存得当,抗体活性大部分都可以维持数年。 请谨记,无论何时请按照说明书推荐的保存条件正确处理和保存抗体。
 
1. 收到抗体后,请务必在4℃,12000rpm,离心3分钟,(无论是液体还是冻干粉状态),再打开管盖进行分装和保存(如果抗体体积小于50ul,请延长 离心时间至5分钟,以保证全部抗体均离心下来)。抗体一般使用特制的储存管,只有在12000rpm离心3分钟,才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下 来(即使是在10000rpm离心也会离心不完全,导致出现抗体的量不足的现象)。
 
2. 对于ProSci大部分抗体,比较合适的保存方式是,分装后保存在-20℃或者-80℃。
(1)对绝大多数抗体来说,保存在-20℃就完全足够了,没有任何证据显示保存在-80℃会更好。
(2)分装可以zui大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害,同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。
(3)分装的量以一次实验用完为好,zui少不能少于10ul每份。因为分装体积越小,抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。
(4)复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在4℃,避免再冻起来。
(5)抗体工作液应该当天配制当天用完,4℃保存尽量不要超过1天。
(6)避免将抗体保存在自动除霜冰箱中,将抗体保存在冰箱里层,避免温度变化造成反复冻融。
 
3. 大部分抗体收到后4℃短暂保存1~2周对抗体活性没有影响。
 
4. 大部分抗体的运输条件:一般的运输过程需要1~2周的时间,所以是在低温4℃的条件下来完成的。
4℃运输zui主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害(如果使用干冰运输,那么收到时抗体是冻起来的,为了分装就需要解冻,这就多了一次冻融的过程),所以运输过程中避免干冰运输。
 
关于叠氮hua na(sodium azide)的使用:
为了防止微生物污染,叠氮hua na经常被加入到抗体中(终浓度0.02% (w/v))。ProSci的绝大部分抗体已经含有了0.02%-0.05%的叠氮hua na,在说明书的储存缓冲液中有标明。
 
注:叠氮hua na的去除方式
可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除,IgG的分子量是150kDa(IgM约600kDa);叠氮hua na的分子量只有65Da,使用截留分子量为14kDa的滤膜即可将叠氮hua na从抗体中去除