上海乔羽生物科技有限公司

https://qybio.biomart.cn

公众号

扫一扫
进入手机商铺

商家诚信度:
成立时间:2015年
入驻丁香通年限:4年
商家等级:金牌客户
产品信息完整度:83%
公众号

微信扫一扫
关注公众号

产品分类
公司荣誉
公司图片
联系方式
 公司地址
上海市浦东新区新场镇笋南路193号
邮编:201200
 联系电话
021-58999639 13310162040
 传真号码
021-50760790
 电子邮箱
3063139112@qq.com
 公司网址
http://www.ym-sw.com
点击这里给我发消息
公司新闻

Elisa实验常见问题及解决方案表格让你一目了然

发布时间:2018-09-21 10:23 |  点击次数:

                   Elisa实验常见问题及解决方案

 
问题 序号 可能原因 解决方法
显色淡,灵敏度偏低 1  试剂盒未充分平衡 试剂盒从2~8℃冰箱取出后打开盒盖,于室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温(约25℃)
2  样品不适合做ELISA检测 样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件(例如稀释液的成分)
3  酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 防止板过于干燥
4  包被抗体遭到破坏 操作温和,移液枪不能碰到孔底
5  样本和抗体孵育条件不合适 按照说明书条件,建议孵育过程中全程振荡孵育。
6  洗涤浸泡时间过长 按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间;
7  偶联HRP试剂污染 弃去试剂,重新配置
8  错误的稀释偶联HRP试剂 弃去试剂,重新配置
9  TMB底物孵育时间过短,因非人为因素影响,需要优化孵育时间 确定合适的孵育时间:人为判定-最高浓度的标准品出现深蓝色;S4-5有淡蓝色;机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65
10  样本浓度过高或存在基质效应 建议做不同稀释倍数,确认样本最佳稀释倍数。
11  酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对 确认仪器设置及选择正确的波长检测。
12  酶标板不适合做ELISA 不能使用细胞培养板,建议使用ELISA专用高吸附力板子。
背景深,全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2) 1  洗涤不充分,洗后未拍干,样品中其它成分残留或酶标记物残留 洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用,不要反复使用,否则易造成污染。
2  底物污染,未避光保存,出现颜色 弃去底物,重新配置
3  样品稀释液污染 弃去稀释液,重新配置
4  吸头重复使用,未洗净或消毒不彻底 吸头尽可能一次性使用
5  不正确的孵育时间,温度(尤其是底物孵育的时间) 最为常用的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃。完全按照说明书要求。
6  偶联抗体(streptavidin-HRP)浓度过高 按照说明书调整到最佳的浓度
7  ELISA板子不正确的贮存 酶标板贮存于2-8 ℃;使用结合力低点的Elisa板
8  没有正确封闭 在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间
9  样本溶血严重 建议使用非溶血或轻微溶血样本,严重溶血样本会导致背景偏高。
重复性不佳,高CV值 1  样品不均一 加样前充分混匀样品,取样确保移液位置一致;
2  包被板表面遭到破坏 洗板加样时尽量小心,避免破坏板的包被表面
3  孔与孔之间的交叉污染 孵育后取下盖子小心操作,避免孔与孔的污染;封板膜不能重复使用
4  加样量不一致 样品稀释前应充分混匀,尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴
5  边缘效应(外周孔显色较中心孔深) 孵育时尽量100 rpm旋转混匀
6  微量加样不准确 保证微量加样的准确性和均一性
7  不正确的洗涤 洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,确定每一步的洗涤
出现白板,阳性对照不显色 1  显色液变质 更换新的显色液
2  洗涤液配制有误 请按说明书所示稀释倍数配制
3  未加酶结合物而认为已加入 注意不要漏加
4  终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 每次加液前均应看清标签
5  标准品稀释方法错误/或标准品有问题 请按照说明书所示配置说明书,注意单位和稀释倍数
6  不同试剂盒或不同批号的试剂混用 建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
不正常的标准曲线 1  错误的方法重悬标准品  加入正确量的溶液重悬标准品,重悬充分
2  标准品稀释错误  按照说明书要求稀释标准品
3  标准品污染  使用一次性的灭菌吸头, 标准品贮存于2-8 ℃
4  错误的倍比稀释步骤  按照说明书倍比稀释标准品
5  波长选择错误 TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用,而 前者比色波长为450nm,后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。
6  标准品混用  不同批号试剂勿混用
7  试剂盒在运输途中时间太长,温度太高,标准品失活  尽量缩短运输时间,夏季应放冰块降温
8  ELISA未终止而直接检测450nm和620nm TMB显色需终止后检测,否则会出现620nm比450nm读数高的现象。(数值仍有梯度规律)
样品或标准品OD超出正常范围 1  错误的样品或标准品的稀释  完全按照说明书稀释
2  偶联抗体浓度过高  按照说明书调整到最佳的浓度
3  TMB底物孵育时间过长  调整到合适的孵育时间
4  样品或标准品污染  避免污染
5  错误的孵育时间或温度  完全按照说明书
6  孵育时未加盖导致溶液挥发和污染  贴封片或加盖
标曲很好,但是样本无法计算到数值 1  标曲选择不合适 选择最合适的标曲拟合;
2  样本含量很低,低于灵敏度无法被检测到 尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测
3 样本含量很高,超过标曲 建议进行预实验摸索稀释倍数,确保样本OD值落在标曲范围内
标曲高浓度间无明显趋势 1 如OD绝对值靠谱,但是仅无梯度,则显色过度 TMB显色体系中建议根据S1,S2颜色进行判断,当S1,S2深蓝色,有明显梯度,S5有淡蓝色时即可终止。
2 仅作单波长检测。 由于参考波长读取非特异性检测,如指纹、划痕、水渍等,对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。