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不看此文,别贸然开始流式实验!

发布时间:2018-09-30 11:47 |  点击次数:

1. 没有从结果反推设计整个实验流程

在最开始就要考虑你将需要在申请或论文中展示的统计数据。所以在你订购第一支试剂或者准备细胞前,更为重要的是从结尾开始去考虑整个实验流程。这意味着要去理解生物学的假说,以及选择哪种统计方法测试该假说是否合理。

正如著名统计学家 Frank Anscombe 说过:「最重要的是我们能意识到真正的问题所在 ,并且尽我们所能去解决它。而不是另外找一个可以完全解决但毫不相干的替代问题。」

理解这些假说以及了解如何测试它们的合理性,可以带领研究人员们走上从实验设计到数据分析再到统计测试的康庄大道。作为奖励,通过为统计测试做准备,您可以预测出实验的规模,从而收集到充足的样本使您实验的最终结果更为可信。

 

 

2. 未能设计合适的抗体配色方案

在理解生物学检测指标后,可以开始进行配色方案设计。

这需要多步骤实现,首先确认检测哪些分群,并且确认最终的结果是检测分群的百分比变化,还是检测一种或多种标志物的表达。

在此基础上,了解仪器和配色方案的荧光染料对进一步设计以减少补偿问题和重要通道分辨率的损失。当设计配色方案时不要遗漏通道或可能用到的染料。同时注意不要在设计配色方案时顾此失彼。


3. 未能优化实验

优化步骤须包括:

A)试剂滴定

在任何流式实验中所使用的试剂都应该进行滴定和优化。 这样做的目的是获得信噪比和减少背景干扰。

B)PMT 电压。

光电倍增管(PMT)灵敏度是基于微珠检测设置的,这将确保进行实验的电压区间 PMT 的敏感度。

该电压可根据特定的细胞/荧光组合进一步进行调整,从而进一步优化检测灵敏度。

4. 未使用正确的对照

为了成功进行流式实验分析,需要在确立稳健的多色配色方案,确定正确对照和进行重复性好的分析上花费大量的时间和精力。研究者最不想看到他们的发现不是由于真正的生物学变化无法被证实,而是由于仪器的问题无法被证实。

除了资源共享实验室和核心设备花费大量的时间在仪器质量控制上,研究人员也会把质量控制结合进他们的实验中。质量控制管能实现确保实验之间的 PMT 电压一致,能确保实验正确进行并且能确保设门策略具有说服力。

5. 未能提供显示或设门策略的细节


对于最终结果的展示,最重要的是可信度和可重复性。在展示设门策略时(即使是在补充材料中),需说明每个区域是如何设置的。诸如使用何种对照和是否使用区域百分比等问题需要进行讨论。

如果使用电子数据,请确保展示了数据的任何转换形式,以及这些数据是如何持续应用的。避免使用单变量图(直方图),确保展示了图上的数据总数,以便理解实验的量级。

最后,不要仅依靠图片。流式细胞术数据可以是非常量化的数据,也可以尽可能地使用表格展示数据。