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凝胶迁移实验（EMSA）技术
人阅读 发布时间：2017-04-07 08:57
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究 DNA 结合蛋白和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究 DNA 结合蛋白，目前已用于研究 RNA 结合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P 同位素标记的 DNA 或 RNA 探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。
DNA-复合物或 RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的 DNA 结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测 RNA 结合蛋白时，依据目的 RNA 结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA 或 RNA 片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定 DNA 或 RNA 结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）常用的实验手段有同位素 32P 法和非同位素法（化学发光法）。
简介：
EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）凝胶迁移实验是一种研究 DNA 与蛋白质或 RNA 与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于 DNA/蛋白质或 RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的 DNA 或 RNA 结合后，其在 PAGE 中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的 DNA，从而检测到活化的与 DNA 或 RNA 结合的蛋白转录或调节因子。
发展：
从发展史来看，这项实验技术起初是用 32P 同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针，但是由于同位素的放射性很强，而且半衰期为 14 天，所以从定购到标记再到做完实验，必须 14 天完成，种种制约因素导致现代科技发展非同位素 EMSA 实验技术，这就出现了 di 高辛标记为探针的非放射 EMSA 实验技术。
在实践中没多久，di 高辛标记为探针的非放射 EMSA 实验技术就暴露了一个严重的缺陷，标记的探真纯化后灵敏度弱，导致实验结果的信号不行，最终就出现了现在的生物素标记探真的 EMSA 实验技术。配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题，到目前为止，生物素标记探真的 EMSA 实验技术广为应用！
EMSA 实验成功的关键因素：
一、实验设计：
主要是你用药品刺激细胞时，设计的药品浓度和时间剃度的问题，这个很关键，很多同学不注意这一点，最后实验确实是拿不到阳性结果，比如我以前一个朋友用药物处理 SGC7901 细胞，就是因为时间点设计的不好，EMSA 实验结果是阴性的，后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度，最终得到阳性结果！所以这个设计很关键！！！
给一个个人的实验总结希望能帮助大家：一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到 EMSA 核转运高峰的时间比较短，大概控制在 30 min~2 h 之间，很多时候都是在 45 min和 1 h 达到高峰，当然还有合适的浓度！！！二是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程。时间可以长一些，主要根据自己的药物刺激特性确定时间点。
二、核蛋白样品的制备：
制备蛋白样品的关键是：①注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像。②掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度。能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是 EMSA 实验对核蛋白的浓度要求还是挺高的！一般要求在 1 ug/ul 以上！有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，否则影响结合反应拿不到结果。这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失。
同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多。而组织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会影响实验结果不容易得到EMSA阳性结果！
三、探针的制备：
又很多站友都在问我生物素标记到 3’端还是 5’端，其实我觉得最好还是两端都标记，这样才能更好的提高灵敏度，国内的标记技术我还不是很了解，我们这边的探真都是国外定做的，还算可以，其制作程序如下：合成寡核苷酸——标记生物素——纯化——退火合成双链。也是一个比较复杂的过程。
四、EMSA 实验技术。这一点主要是操作的细节问题！下面会更细的谈到。关于技术要点，我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作，其他的照正常程序就可以了！
1. 制胶
必须是非变性 PAGE 凝胶，我们实验室一般用 6.5% 的非变性胶。制胶很重要，直接影响电泳的效果！一般控制在 5 分钟凝固的效果。
10X TBE 1.0ml
40% Acrylamide（40% 聚丙烯酰胺） 3.3 ml
50% Glycerol（50% 甘油） 1.0 ml
dH2O（蒸馏水） 14.8 ml
TEMED（四甲基乙二氨） 20 µl
脱气 10 min
10% AP（过硫酸氨） 120 µl
总量 20.0 ml
2. 一般试剂盒包括的试剂
l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）（-20 ℃）
l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）（-20 ℃）
l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）（4 ℃）
l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）（-20 ℃）
l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）（-20 ℃）
l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）（4 ℃）
l 2×Blocking Buffer（2× 封闭液）（4 ℃）
l 5×Washing Buffer（5× 洗涤液）（4 ℃）
l Equilibration Solution（平衡液）（4 ℃）
l Binding-membrane（结合反应膜）（RT）
3. 结合反应
每次结合反应需 1-5µl 核蛋白（根据核蛋白浓度而定），根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15 µl
（1） 结合反应体系：
10X 结合反应液 1.5 µl
Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0 µl
细胞核提取物* µl
双蒸水* µl
混匀室温静置 20 分钟
生物素标记的探针 0.5 µl
总量 15 µl
混匀室温静置 20 分钟或以上。
（2）特异性反应确认竞争反应体系：
10X 结合反应液 1.5 µl
Poly（dI:dC）（dI:dC）1.0 µl
细胞核提取物 µl
未标记的竞争性寡核 2.0 µl
双蒸水* µl
混匀室温静置 20 分钟
生物素标记的探针 0.5 µl
总量 15 µl
混匀室温静置 20 分钟或以上。
其中:
探针用量：这相当于 10-50 fmoles 的 DNA 探针。我们通常是最少 50 fmol。
蛋白样品用量：一般用量在 2~20 ug（控制在 1~5 µl）蛋白，总体系 15 ul。细胞核抽屉物浓度都比较低，组织的一般都比较高，因为杂蛋白较多。
poly(dI:dC)(dI:dC)：由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入 poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它 DNA 结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入 poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过 50~100 ng。对核抽提液：每 2~3 ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。
未标记的竞争性寡核：做为竞争的探真来说，其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸，用量一般是正常探真的50~100倍。再这里我引申的解释一下其他的对照的含义：
4. 预电泳和电泳：0.25X TBE在冰上 120 V 预电泳 1 小时；务必换掉预电泳的缓冲液，用新的 0.25X TB 低温下 150 V，电泳约 60 分钟。注意横压电泳的时候注意电流的数字变化，记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化！
5. 电转运：在 0.5X TBE 中 390 mA 电转移 40 分钟，注意转运膜的选择，有一种离子加强型的转运效果比较好！我当初选择过一般的和离子加强型的，还是离子加强型结合效果好！
6.紫外交联：正规的应该是紫外交联仪的使用，但是很多单位没有交联仪，那就用无菌操作台上的紫外等下 10 cm 处交联 10 分钟就可以了！
7. 化学发光反应
包括 Blocking Buffer 30 分钟封闭，Streptavidin-HRP 标记，Washing Buffer 洗涤；Equilibration Solution 平衡，这些按照规定操作即可！没有太多的细节，只是注意两点，一是期间结合膜的表面一定不能干燥！！！二是 Streptavidin-HRP 不能加在膜上，而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴。
8. 化学发光图像显示
两种方法：化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像。
文章由上海乔羽生物提供，仅供参考！
DNA-复合物或 RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的 DNA 结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测 RNA 结合蛋白时，依据目的 RNA 结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。
竞争实验中采用含蛋白结合序列的 DNA 或 RNA 片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定 DNA 或 RNA 结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）常用的实验手段有同位素 32P 法和非同位素法（化学发光法）。
简介：
EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）凝胶迁移实验是一种研究 DNA 与蛋白质或 RNA 与蛋白质相互作用的常用技术。这项技术是基于 DNA/蛋白质或 RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的 DNA 或 RNA 结合后，其在 PAGE 中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的 DNA，从而检测到活化的与 DNA 或 RNA 结合的蛋白转录或调节因子。
发展：
从发展史来看，这项实验技术起初是用 32P 同位素标记人工合成的寡核苷酸形成探针，但是由于同位素的放射性很强，而且半衰期为 14 天，所以从定购到标记再到做完实验，必须 14 天完成，种种制约因素导致现代科技发展非同位素 EMSA 实验技术，这就出现了 di 高辛标记为探针的非放射 EMSA 实验技术。
在实践中没多久，di 高辛标记为探针的非放射 EMSA 实验技术就暴露了一个严重的缺陷，标记的探真纯化后灵敏度弱，导致实验结果的信号不行，最终就出现了现在的生物素标记探真的 EMSA 实验技术。配合化学发光技术良好的解决了灵敏度的问题，到目前为止，生物素标记探真的 EMSA 实验技术广为应用！
EMSA 实验成功的关键因素：
一、实验设计：
主要是你用药品刺激细胞时，设计的药品浓度和时间剃度的问题，这个很关键，很多同学不注意这一点，最后实验确实是拿不到阳性结果，比如我以前一个朋友用药物处理 SGC7901 细胞，就是因为时间点设计的不好，EMSA 实验结果是阴性的，后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度，最终得到阳性结果！所以这个设计很关键！！！
给一个个人的实验总结希望能帮助大家：一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到 EMSA 核转运高峰的时间比较短，大概控制在 30 min~2 h 之间，很多时候都是在 45 min和 1 h 达到高峰，当然还有合适的浓度！！！二是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程。时间可以长一些，主要根据自己的药物刺激特性确定时间点。
二、核蛋白样品的制备：
制备蛋白样品的关键是：①注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像。②掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度。能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是 EMSA 实验对核蛋白的浓度要求还是挺高的！一般要求在 1 ug/ul 以上！有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，否则影响结合反应拿不到结果。这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失。
同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多。而组织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会影响实验结果不容易得到EMSA阳性结果！
三、探针的制备：
又很多站友都在问我生物素标记到 3’端还是 5’端，其实我觉得最好还是两端都标记，这样才能更好的提高灵敏度，国内的标记技术我还不是很了解，我们这边的探真都是国外定做的，还算可以，其制作程序如下：合成寡核苷酸——标记生物素——纯化——退火合成双链。也是一个比较复杂的过程。
四、EMSA 实验技术。这一点主要是操作的细节问题！下面会更细的谈到。关于技术要点，我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作，其他的照正常程序就可以了！
1. 制胶
必须是非变性 PAGE 凝胶，我们实验室一般用 6.5% 的非变性胶。制胶很重要，直接影响电泳的效果！一般控制在 5 分钟凝固的效果。
10X TBE 1.0ml
40% Acrylamide（40% 聚丙烯酰胺） 3.3 ml
50% Glycerol（50% 甘油） 1.0 ml
dH2O（蒸馏水） 14.8 ml
TEMED（四甲基乙二氨） 20 µl
脱气 10 min
10% AP（过硫酸氨） 120 µl
总量 20.0 ml
2. 一般试剂盒包括的试剂
l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）（-20 ℃）
l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）（-20 ℃）
l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）（4 ℃）
l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）（-20 ℃）
l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）（-20 ℃）
l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）（4 ℃）
l 2×Blocking Buffer（2× 封闭液）（4 ℃）
l 5×Washing Buffer（5× 洗涤液）（4 ℃）
l Equilibration Solution（平衡液）（4 ℃）
l Binding-membrane（结合反应膜）（RT）
3. 结合反应
每次结合反应需 1-5µl 核蛋白（根据核蛋白浓度而定），根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15 µl
（1） 结合反应体系：
10X 结合反应液 1.5 µl
Poly(dI:dC)(dI:dC) 1.0 µl
细胞核提取物* µl
双蒸水* µl
混匀室温静置 20 分钟
生物素标记的探针 0.5 µl
总量 15 µl
混匀室温静置 20 分钟或以上。
（2）特异性反应确认竞争反应体系：
10X 结合反应液 1.5 µl
Poly（dI:dC）（dI:dC）1.0 µl
细胞核提取物 µl
未标记的竞争性寡核 2.0 µl
双蒸水* µl
混匀室温静置 20 分钟
生物素标记的探针 0.5 µl
总量 15 µl
混匀室温静置 20 分钟或以上。
其中:
探针用量：这相当于 10-50 fmoles 的 DNA 探针。我们通常是最少 50 fmol。
蛋白样品用量：一般用量在 2~20 ug（控制在 1~5 µl）蛋白，总体系 15 ul。细胞核抽屉物浓度都比较低，组织的一般都比较高，因为杂蛋白较多。
poly(dI:dC)(dI:dC)：由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入 poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它 DNA 结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入 poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过 50~100 ng。对核抽提液：每 2~3 ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。
未标记的竞争性寡核：做为竞争的探真来说，其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸，用量一般是正常探真的50~100倍。再这里我引申的解释一下其他的对照的含义：
- 常规反应（含激活的目的转录因子的核蛋白 + 标记探针）；
- 阴性对照反应（核蛋白 + 标记探针）；
- 阳性对照（核蛋白 + 标记探针）；
- 探针冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白 + 标记探针 + 标记探针 100 倍量的未标记探针）；
- 突变探针的冷竞争反应（含激活的目的转录因子的核蛋白 + 标记探针 + 标记探针 100 倍量的未标记突变探针）；
- Super-shift 反应（含激活的目的转录因子的核蛋白 + 标记探针 + 目的转录因子的特异抗体）。
4. 预电泳和电泳：0.25X TBE在冰上 120 V 预电泳 1 小时；务必换掉预电泳的缓冲液，用新的 0.25X TB 低温下 150 V，电泳约 60 分钟。注意横压电泳的时候注意电流的数字变化，记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化！
5. 电转运：在 0.5X TBE 中 390 mA 电转移 40 分钟，注意转运膜的选择，有一种离子加强型的转运效果比较好！我当初选择过一般的和离子加强型的，还是离子加强型结合效果好！
6.紫外交联：正规的应该是紫外交联仪的使用，但是很多单位没有交联仪，那就用无菌操作台上的紫外等下 10 cm 处交联 10 分钟就可以了！
7. 化学发光反应
包括 Blocking Buffer 30 分钟封闭，Streptavidin-HRP 标记，Washing Buffer 洗涤；Equilibration Solution 平衡，这些按照规定操作即可！没有太多的细节，只是注意两点，一是期间结合膜的表面一定不能干燥！！！二是 Streptavidin-HRP 不能加在膜上，而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴。
8. 化学发光图像显示
两种方法：化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像。
文章由上海乔羽生物提供，仅供参考！
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